西方墨點法（Western Blot, WB）是蛋白質研究中最基本且應用最廣的免疫偵測技術。儘管已發展數十年，其方法學的優化和標準化仍在持續。
SDS-PAGE 的物理化學基礎
SDS 以約 1.4 g SDS / g protein 的固定比例結合蛋白質，賦予均勻的電荷-質量比（~1 negative charge per 2 amino acids）。在均質凝膠中，蛋白質的電泳遷移率與 log(MW) 呈線性關係——此為 Ferguson 圖的理論基礎。梯度凝膠（gradient gel, 如 4-20%）可擴大線性分離範圍。Bis-Tris 緩衝系統（NuPAGE）在中性 pH 下操作，減少蛋白質降解和化學修飾。
對於極大（>200 kDa）或極小（<10 kDa）蛋白質，標準 SDS-PAGE 可能不適用：前者可使用低百分比凝膠或瓊脂糖凝膠，後者可使用 Tris-Tricine 系統。糖蛋白因糖基化影響 SDS 結合而可能出現異常遷移行為。
轉印效率的優化
轉印是 Western blot 中最易失敗的步驟。影響因素包括：蛋白質大小（大蛋白質轉印效率低，可延長時間或加 SDS）、甲醇濃度（增加蛋白質與膜結合力但可能使凝膠收縮）、膜材質（PVDF 疏水性強、蛋白質結合容量高、機械強度好；硝化纖維素背景低但脆弱）。
Tank transfer（4°C, 100V, 1-2 hr 或 30V overnight）適合大蛋白質；semi-dry（25V, 30 min）快速但對 >150 kDa 蛋白質效率差。近年的 turbo transfer 系統（如 Bio-Rad Trans-Blot Turbo）使用高安培電流和最佳化緩衝液，可在 7 分鐘內完成。
抗體選擇與驗證
一級抗體的特異性是 WB 結果可靠性的關鍵。多株抗體（polyclonal）辨識多個表位，靈敏度高但批次差異大；單株抗體（monoclonal）特異性高且可無限生產，但可能受表位構象影響。
抗體驗證的黃金標準（Bhatt et al., J Biol Chem, 2015 editorial guidelines）包括：（1）基因敲除/敲降（KO/KD）的陰性對照；（2）已知陽性組織/細胞株；（3）與正交方法（如 MS）交叉驗證；（4）多個針對同一靶標不同表位的抗體互相驗證。「再現性危機」（reproducibility crisis）中，不良抗體是一個重要因素。
定量 Western Blot 的方法學
傳統 ECL 的動態範圍窄（~10 倍），且信號隨時間衰減，不適合精確定量。改良方法包括：
- 螢光 Western blot（如 LI-COR Odyssey 系統）：使用近紅外螢光二級抗體，動態範圍可達 4 個數量級，允許多重偵測（multiplex），且不受曝光時間影響。
- 毛細管電泳免疫分析（如 ProteinSimple Wes/Jess）：自動化微流體系統，僅需微量樣品，重現性好但凝膠分離能力不如傳統 PAGE。
- 標準化：使用 total protein staining（如 Ponceau S、Stain-Free gels、REVERT total protein stain）替代單一 housekeeping gene（如 β-actin、GAPDH）作為 loading control——後者的表現量可能因實驗條件而變動。
進階應用
- Co-immunoprecipitation + WB（Co-IP/WB）：偵測蛋白質-蛋白質交互作用
- Phospho-specific WB：使用位點特異性磷酸化抗體追蹤信號傳導活化
- Far-Western blot：用標記的蛋白質探針（非抗體）偵測蛋白質-蛋白質直接結合
- Native PAGE + WB：在非變性條件下分離蛋白質複合體，保留生物活性