蛋白質純化是生化研究的核心技術，現代方法論強調理性設計純化策略（rational purification design）與高通量篩選（HTS）的結合。
表達系統與溶解度工程
重組蛋白表達系統的選擇直接影響純化策略。大腸桿菌（E. coli）系統產量高但缺乏翻譯後修飾，且過表達常導致包涵體（inclusion bodies）形成。包涵體的再摺疊（refolding）需先以 6-8 M urea 或 6 M guanidine HCl 溶解，再透過稀釋法、透析或管柱上再摺疊（on-column refolding）恢復天然構象。融合標籤策略：MBP（maltose-binding protein）和 SUMO 標籤可顯著提高目標蛋白的溶解度，後者以 SUMO protease（Ulp1）特異性切除，不留額外殘基。
親和層析的進階應用
IMAC（Immobilized Metal Affinity Chromatography）：His₆-tag 蛋白質與 Ni²⁺-NTA 或 Co²⁺ 樹脂結合，以咪唑梯度洗脫。注意事項：組胺酸豐富的內源蛋白（如 SlyD）會共純化；EDTA 或 high imidazole wash 可提高專一性。Strep-tag II 與 Strep-Tactin 樹脂的親和力（Kd ~1 μM）低於 His-tag/Ni-NTA，但專一性更高，適合需要高純度的結構研究。
Flag-tag 和 HA-tag 使用抗體親和層析，洗脫條件較溫和（pH shift 或 competing peptide），但成本高且管柱容量有限。蛋白質 A/G 親和層析用於抗體純化，利用 IgG Fc 區域的結合。
離子交換的理論基礎
蛋白質在 pH ≠ pI 時帶淨電荷。實務上，選擇 pH 使目標蛋白與樹脂帶相反電荷：若 pI < 7，用 pH 8 的陰離子交換（Q-Sepharose）；若 pI > 7，用 pH 6 的陽離子交換（SP-Sepharose）。洗脫以 NaCl 線性梯度（0-1 M）進行。Donnan 效應和非特異性疏水交互作用會影響實際滯留行為。高解析度離子交換（MonoQ/MonoS）使用 10 μm 均勻粒徑，理論板數顯著優於傳統樹脂。
多維層析與自動化
ÄKTA 系統（Cytiva）支援多步驟自動化純化。典型的三步驟策略遵循 CIPP 原則（Capture → Intermediate purification → Polishing）：IMAC capture → ion exchange intermediate → gel filtration polishing。SEC-MALS（size exclusion chromatography with multi-angle light scattering）同時提供分子量和多分散度（polydispersity）資訊，是結構研究前的品質控制金標準。
純化表的統計意義
純化表（purification table）記錄每步的 total protein、total activity、specific activity、fold purification 和 yield。比活性（specific activity）的單位通常為 μmol/min/mg（U/mg）。一個典型的酵素純化可能達到 1000-5000 倍純化，最終回收率 5-20%。Bradford assay 受界面活性劑干擾，BCA assay 受還原劑干擾——選擇定量方法時需考慮緩衝液組成。