蛋白質理性設計的計算方法學、AI 驅動的設計革命與臨床轉譯構成結構生物學與合成生物學的交匯前沿。
Rosetta 能量函數的演進
Rosetta 的 scoring function 歷經 score12 → Talaris → REF2015 → beta_nov16 的迭代。REF2015（Park et al., 2016, J Chem Theory Comput）整合 van der Waals、electrostatics（Coulombic + GB implicit solvent）、hydrogen bonding、solvation（Lazaridis-Karplus）、Ramachandran torsion preferences。Design 以 FastDesign protocol（coupled rotamer + backbone minimization）在 ~10⁶ rotamer 組合中搜索最低能量序列。
AI 蛋白質設計的技術棧
- Structure prediction：AlphaFold2 以 Evoformer + structure module 預測結構。ESMFold（Lin et al., 2023）以 single-sequence（不需 MSA）在毫秒級預測，適合高通量設計 pipeline。
- Backbone generation：
- RFdiffusion（Watson et al., 2023）：SE(3)-equivariant denoising diffusion on protein frames。Conditioning 方式：hotspot residues、symmetric oligomers、binder design。
- Chroma（Ingraham et al., 2023）：similar diffusion approach，Illumina/Generate Biomedicines。
- FrameDiff（Yim et al., 2023）：Riemannian diffusion on SE(3) manifold。
- Sequence design：
- ProteinMPNN：message passing GNN on kNN backbone graph → per-residue amino acid probability。Temperature sampling 控制 diversity/accuracy tradeoff。
- ESM-IF1（inverse folding）：以 GVP-GNN encoder + transformer decoder 設計序列。
- Validation pipeline：AF2/ESMFold structure prediction → pLDDT filter (>85) → pTM filter (>0.8) → expression test → biophysical characterization。
從零設計的里程碑
- Top7（Kuhlman et al., 2003, Science）：首個完全從零設計的穩定折疊蛋白質（~100 aa, α/β fold），無自然界同源物。
- Kemp eliminase（Jiang et al., 2008, Science; Rothlisberger et al., 2008, Nature）：Rosetta 設計的人工酵素；初始活性低，但經定向演化提升 >1000 倍——展示 rational design + directed evolution 的互補威力。
- De novo binders：Cao et al.（2022, Nature）以 RFdiffusion + ProteinMPNN 設計靶向 SARS-CoV-2 RBD 的 de novo mini-proteins，實驗驗證 Kd <1 nM，保護動物免受感染。
- De novo enzymes：Yeh et al.（2023, Nature）以 RFdiffusion + active site scaffolding 設計 luciferase，活性超越天然酵素。
臨床轉譯
- 抗體工程：CDR grafting + framework optimization + Fc engineering（LALA-PG for effector-silent, YTE for half-life extension）以理性設計為主。
- 疫苗設計：RSV prefusion-stabilized F protein（DS-Cav1, McLellan et al., 2013, Science）以結構引導的 disulfide bond + cavity-filling mutations 穩定 prefusion 構型。此設計直接導致 Arexvy（GSK, 2023）和 Abrysvo（Pfizer, 2023）RSV 疫苗獲批。
文獻參考：Jumper, J. et al. (2021). Nature, 596, 583-589. / Watson, J.L. et al. (2023). Nature, 620, 1089-1100. / Dauparas, J. et al. (2022). Science, 378, 49-56. / Kuhlman, B. et al. (2003). Science, 302, 1364-1368.