Western Blot（免疫印跡法）由 Towbin et al.（1979）和 Burnette（1981）建立，結合 SDS-PAGE 的分子量分離能力與免疫偵測的表位專一性，至今仍是蛋白質研究中最基礎且最被廣泛引用的技術之一。然而，其半定量本質和可重複性問題近年受到嚴格審視。
SDS-PAGE 的物理化學基礎
SDS 是陰離子界面活性劑，與蛋白質以約 1.4 g SDS / g protein 的固定比率結合，將蛋白質展開為棒狀構象，使原始電荷被掩蓋。在 Laemmli 不連續緩衝系統中，堆疊膠（stacking gel, ~4% acrylamide, pH 6.8）利用 Kohlrausch 調節效應將樣本壓縮成薄帶，分離膠（resolving gel, 8-15% acrylamide, pH 8.8）依 Ferguson 關係（log mobility vs. %T 呈線性）實現分子量依賴的分離。梯度膠（如 4-20%）可在單次電泳中涵蓋更寬的分子量範圍。
對於 >250 kDa 的蛋白質（如 mTOR, dystrophin），低百分比膠或脈衝場電泳可改善分離。膜蛋白因疏水性高，常需特殊處理（如使用 Triton X-100 或藍色原生 PAGE 保留原始構象）。
轉印的關鍵變數
濕式轉印效率高但耗時，適合大分子量蛋白；半乾式快速但對 >150 kDa 蛋白質效率下降。Trans-Blot Turbo 等快速系統使用高場強短時間轉印（7 min），但需優化以避免過度加熱。PVDF 膜（0.45 μm 或 0.2 μm 孔徑）蛋白質結合容量約 150-200 μg/cm²，低分子量蛋白質需用 0.2 μm 避免穿透。甲醇在轉印緩衝液中固定蛋白質於膜上但也縮小膠體孔徑，對大蛋白不利——此時可降低甲醇比例或加入 SDS。
定量的挑戰與最佳實踐
傳統 ECL+底片曝光的動態範圍僅約 1.5 個數量級，極易飽和。螢光 Western（如 LI-COR Odyssey 近紅外螢光系統）動態範圍可達 4 個數量級，且支援同時偵測兩個目標（雙色螢光），顯著改善定量準確性。
內參蛋白的選擇需謹慎：β-actin 和 GAPDH 在缺氧、癌症和代謝疾病中表達量會改變。Total protein staining（Ponceau S、Stain-Free 技術或 REVERT total protein stain）作為標準化基準越來越受推薦（Bhatt et al., 2022 meta-analysis）。
可重複性危機與規範
Western Blot 是生物醫學圖像造假的重災區（圖片重複使用、條帶裁剪拼接）。2016 年 Bhatt & bhatt 團隊的分析指出約 1/25 的論文含有不當 WB 圖像。因此，越來越多期刊要求提供原始未裁剪膜的完整影像、分子量標記可見、並揭露曝光時間等細節。MIQE-like 的報告指引正在被倡導。
替代與互補技術
毛細管 Western（如 ProteinSimple Jess/Wes 系統）將 SDS-PAGE、轉印和免疫偵測整合在毛細管中，僅需 3 μL 樣本，全自動運行約 3 小時，定量重現性優於傳統 WB。質譜為基礎的目標蛋白質組學（SRM/MRM/PRM）可提供絕對定量且不依賴抗體，但設備門檻高。在臨床上，HIV 確認試驗已從 WB 轉向更靈敏的第四代 Ag/Ab 組合檢測加上核酸檢測（NAT）演算法。