流式細胞術（Flow Cytometry）是免疫學中最核心的技術平台之一。從 1970 年代的單雷射雙色分析到當代的全光譜流式（spectral cytometry）和質譜流式（mass cytometry / CyTOF），這項技術持續推動免疫學的發現。
技術演進與原理
傳統流式細胞術使用帶通濾波器（bandpass filters）從每個偵測器通道收集特定波長範圍的螢光。光譜重疊需要數學補償（compensation），原理是從相鄰通道減去溢出的螢光百分比（計算自單染色對照）。隨著同時使用的螢光素增加（現代儀器可達 40+ 參數），補償矩陣的複雜度急劇上升，螢光板設計（panel design）成為關鍵技藝——需考慮螢光素亮度、抗原表達密度和光譜溢出的最佳配對。
全光譜流式細胞術（Spectral Flow Cytometry）是近年最重要的技術突破。與傳統流式不同，全光譜儀器在所有偵測通道收集每個螢光素的完整發射光譜，然後透過 spectral unmixing 演算法（而非簡單的補償矩陣）分離重疊的螢光貢獻。這允許使用發射光譜高度重疊但仍可數學區分的螢光素組合，突破傳統面板設計的限制（Nolan & Condello, 2013, Current Protocols in Cytometry）。
CyTOF（質譜流式細胞術）
CyTOF 使用金屬同位素標記的抗體取代螢光素。細胞通過電漿噴射器（inductively coupled plasma, ICP）霧化後，金屬離子由飛行時間質譜儀（TOF-MS）偵測。金屬同位素的訊號幾乎不重疊，可同時測量 50+ 參數且無需補償。CyTOF 的革命性應用包括 Bendall et al.（2011, Science）使用 34 參數 CyTOF 一次性解析人類造血系統的分化軌跡，以及 Spitzer et al.（2017, Cell）利用 CyTOF 建立全身免疫細胞系統圖譜。
CyTOF 的局限包括：(i) 事件收集速率較低（300-500 events/s vs 流式的 >10,000 events/s），(ii) 細胞在過程中被破壞（不能排序），(iii) 缺乏散射光參數。
FACS 分選（Fluorescence-Activated Cell Sorting）
在流式分析的基礎上，FACS 可以將特定表型的細胞物理分離出來。原理是在液滴形成點（droplet break-off point）對含目標細胞的液滴施加電荷，由偏轉板引導至收集管。現代高速分選器（如 BD FACSAria Fusion）可達 70,000 events/s 的分選速率。FACS 分選的細胞可用於後續的基因組分析（單細胞 RNA-seq 的起始材料）、功能測定或體外培養。
高維數據分析
20+ 參數的流式/CyTOF 數據超越了傳統人工 gating 的能力，推動了計算分析方法的發展：
(1) 降維算法：tSNE（t-distributed stochastic neighbor embedding）和 UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）將高維數據映射到 2D 空間可視化。UMAP 通常優於 tSNE 的全局結構保留和計算速度（Becht et al., 2019, Nature Biotechnology）。
(2) 自動聚類算法：FlowSOM（self-organizing maps）、PhenoGraph（k-nearest neighbor graph + Louvain community detection）和 Leiden 算法可自動鑑定細胞亞群，減少人工偏差。
(3) 差異豐度分析：diffcyt 框架使用 GLMM（generalized linear mixed models）比較不同條件間的細胞亞群豐度和標記表達差異（Weber et al., 2019, Communications Biology）。
臨床免疫學應用
(1) HIV 監測：CD4+ T 細胞絕對計數是 AIDS 分期和 HAART 啟動的關鍵指標。(2) 白血病/淋巴瘤免疫分型：多色流式的 EuroFlow 標準化面板可準確分類 B-ALL、T-ALL、AML 和各型淋巴瘤——MRD（minimal residual disease）偵測靈敏度達 10⁻⁴ 至 10⁻⁵。(3) PID 篩檢：DHR 測試（CGD）、TREC/KREC 新生兒篩檢（SCID）後的確認性免疫分型。(4) CAR-T 監測：追蹤 CAR-T 細胞擴增動力學和 B 細胞恢復。