大3 · 第1學期微生物學病毒學基礎

病毒複製

Virus Replication

難度 3 · 進階microbiologyvirology想做成互動版

病毒複製循環的分子解構是抗病毒治療、疫苗、基因治療載體、合成生物學底盤的基礎。近二十年 single-molecule imaging、live-cell microscopy、CRISPR screen、cryo-ET 已將每一階段的分子動態揭示至前所未有的細節。

一、受體結合的分子動力學

受體結合不是單一事件，而是 multi-step 過程：

Attachment factor（非專一結合，如 heparan sulfate）先聚集病毒於細胞表面
Primary receptor 觸發構象變化
Co-receptor / activating protease（TMPRSS2 for SARS-CoV-2、furin for many viruses、CCR5 for HIV）觸發膜融合啟動
SARS-CoV-2 S 蛋白的 RBD up/down 構象切換、S1/S2 furin cleavage、S2' 位點 TMPRSS2 cleavage 的級聯機制由 cryo-EM 與 smFRET 揭示（Lu et al., 2020, Nat Struct Mol Biol; Walls et al., 2020, Cell）

二、進入路徑的多樣性

pH-dependent endocytic entry：流感、VSV、SARS-CoV（non-TMPRSS2 route）依賴 endosomal acidification 觸發 HA2 低 pH fusion
Plasma membrane fusion：HIV、paramyxovirus、TMPRSS2-expressing cells 的 SARS-CoV-2
Macropinocytosis：Ebola、vaccinia 利用 large-volume uptake
Caveolae-mediated：SV40 利用 caveolin-1 vesicles，bypass 傳統 endosome

三、複製機器的分子生物學

RdRp 結構與功能：所有 RNA 病毒的共同核心。SARS-CoV-2 nsp12+nsp7+nsp8 複合體被 remdesivir（delayed chain termination）、molnupiravir（lethal mutagenesis via NHC incorporation）、nirmatrelvir-ritonavir（protease inhibitor, 上游於 RdRp）靶向
Influenza cap-snatching：PB2 結合宿主 5' cap，PA endonuclease 切取 10-13 nt 當 primer，PB1 延伸，baloxavir 靶向 PA endonuclease（Hayden et al., 2018, NEJM）
Retroviral RT：HIV RT 缺 proofreading，每 complete cycle ~1 突變／genome，造就 quasispecies；NRTI（AZT、TDF、FTC）chain termination、NNRTI（efavirenz、rilpivirine、doravirine）allosteric inhibition
HBV reverse transcription：從 pgRNA 5' 結合 polymerase，蛋白啟動 priming（非 RNA primer），ε 結構為 assembly signal（Hu & Seeger, 2015, Cold Spring Harb Perspect Med）

四、Membrane rearrangement 與複製工廠

正鏈 RNA 病毒普遍誘導 ER-derived membrane 重組形成 replication organelles：

Poliovirus、coxsackievirus：double-membrane vesicles（autophagosome-like）
SARS-CoV-2：nsp3/4/6 誘導 convoluted membranes + double-membrane vesicles + spherules（Wolff et al., 2020, Nat Rev Microbiol）
Flavivirus（dengue、Zika）：ER invagination 形成 vesicle packet
這些結構保護 dsRNA replication intermediate 逃避 RIG-I/MDA5 偵測，也集中代謝酶與複製因子

五、Innate immune 偵測與 antagonism

RIG-I 感知 5'-triphosphate + panhandle dsRNA（流感、狂犬）；MDA5 感知 long dsRNA（picornavirus、coronavirus）
cGAS 感知細胞質 DNA（HSV、HBV、HIV RT 中間產物）
病毒 antagonist：流感 NS1、Ebola VP35、SARS-CoV-2 ORF6/N/nsp1、HCV NS3/4A（剪切 MAVS、TRIF）

六、組裝的分子機制

HIV Gag：N 端 myristoylation 膜錨定，MA（matrix）目標膜，CA（capsid）六聚體組 hexameric lattice，NC（nucleocapsid）結合 Ψ packaging signal RNA，p6 招募 ESCRT（TSG101、ALIX）完成 scission
Flavivirus：E-prM 異二聚體組裝 immature virion，在 TGN 經 furin 成熟，prM 切離暴露 E fusion loop
Poliovirus capsid：P1 polyprotein 剪成 VP0、VP1、VP3，與 RNA 結合後 VP0 切成 VP4+VP2 完成成熟

七、釋放機制

ESCRT-mediated budding：HIV、Ebola、arenavirus 劫持 ESCRT-I/III 與 VPS4 完成 membrane scission（Votteler & Sundquist, 2013, Cell Host Microbe）
Budding 無 ESCRT：流感 M2 與 M1 自驅動，HA/NA cholesterol raft 聚集
Lysis via viroporin：polio 2B、coronavirus E、HIV Vpu 改變膜通透性；HBV 分泌 HBsAg 小體
Cell-to-cell spread：HIV virological synapse、HSV US3-dependent 突觸、vaccinia actin tail 均避開中和抗體

八、Lysis vs. Lysogeny 決策的系統生物學

Lambda phage CI/Cro bistable switch 是經典範例（Ptashne, A Genetic Switch）。決策受 MOI、宿主代謝狀態、stress response 影響。溶原性 prophage 常攜帶 virulence gene（白喉毒素、Shiga 毒素、SPI 島），horizontal gene transfer 的主要驅動力。溫和噬菌體基因組可佔細菌基因組 10-20%，稱為 "accessory genome"。

九、抗病毒藥物開發的系統論

每一階段皆有臨床藥物，組合療法（如 HIV HAART/cART、HCV DAA）已證實可壓制病毒或達到臨床治癒。近期突破：

Remdesivir、molnupiravir、nirmatrelvir：SARS-CoV-2 RdRp 與 Mpro 靶向（Owen et al., 2021, Science）
Lenacapavir：HIV capsid 穩定劑，6 個月長效注射（Segal-Maurer et al., 2022, NEJM）
siRNA / ASO：靶向病毒 RNA（HBV 的 bepirovirsen、HDV 的 lonafarnib 組合）
Broadly neutralizing Abs：passive immunization 與治療（HIV VRC01、SARS-CoV-2 sotrovimab、Ebola mAb114）

十、新興議題