螢光原位雜交（FISH）自 Bauman et al.（1980）首次以螢光取代放射性同位素標記以來，已發展成分子細胞遺傳學的核心技術，並衍生出多種高解析度和高通量變體，在臨床診斷、癌症基因組學和基礎研究中持續發揮不可替代的作用。
技術原理與探針設計
探針標記策略主要有兩種：直接標記（螢光團如 Cy3、FITC、Alexa Fluor 直接偶聯至核苷酸）和間接標記（以 biotin 或 digoxigenin 標記核苷酸，再用 streptavidin-螢光或 anti-dig 抗體偵測，可多輪放大信號）。探針來源包括 BAC clone（100-200 kb，LSI probe 的主流來源）、fosmid（~40 kb）、PCR 產物和合成寡核苷酸（oligo FISH）。
雜交動力學遵循 Cot 分析原則——重複序列（如 Alu、LINE）會先於唯一序列雜交，因此需加入未標記的 Cot-1 DNA 競爭性抑制重複序列的非特異性雜交。雜交嚴格度（stringency）由溫度、甲醯胺濃度和鹽濃度控制，影響錯配容忍度。
進階 FISH 變體
M-FISH / SKY：Speicher et al.（1996）和 Schröck et al.（1996）分別開發了多色 FISH 和光譜核型分析，以 5 種螢光團的組合標記 24 種人類染色體，透過光譜解混（spectral unmixing）或比例分析實現全基因組染色體辨識。對隱匿性易位和複雜重排的偵測優於常規 G-banding。
Fiber FISH / Molecular Combing：在拉直的 DNA 纖維（~2-3 kb/μm）上進行 FISH，解析度可達 1-5 kb，用於精確定位斷裂點、分析基因結構和重複序列拷貝數。Genomic Vision 的分子梳技術已應用於 FSHD 的 D4Z4 重複計數。
smFISH（single-molecule FISH）：Raj et al.（2008）開發的單分子 RNA FISH 使用 20-48 個短寡核苷酸探針（每個 ~20 nt，帶一個螢光團）同時靶向一條 mRNA，每條 mRNA 形成一個可量化的衍射限制亮點。可在單細胞水平絕對定量 mRNA 拷貝數並解析空間分布。seqFISH 和 MERFISH 進一步將 smFISH 擴展至空間轉錄組學——MERFISH（Chen et al., 2015）使用二進位條碼化和多輪成像，可同時偵測單細胞內 >10,000 個基因的空間表達。
immuno-FISH：結合免疫螢光和 FISH，可在同一細胞中同時偵測蛋白質和 DNA/RNA 目標。常用於研究端粒與 PML 體的共定位（ALT 機制）、DNA 損傷位點的染色體定位等。
臨床應用的深度
血液腫瘤：FISH 是 WHO 分類和 NCCN 指南中多種血液惡性腫瘤診斷和預後分層的必要工具。AML 中的 PML-RARA（APL）、RUNX1-RUNX1T1、CBFB-MYH11；ALL 中的 ETV6-RUNX1、BCR-ABL1、KMT2A 重排；多發性骨髓瘤中的 del(17p)/TP53、t(4;14)、t(14;16)、gain(1q) 等均依賴 FISH 檢測。
實體腫瘤：HER2 FISH 是乳癌 IHC 2+ 病例的確認性檢測（ASCO/CAP 指南）。ALK 和 ROS1 break-apart FISH 是 NSCLC 標靶治療的 companion diagnostic。MDM2 擴增 FISH 區分脂肪肉瘤與良性脂肪瘤。
與新興技術的互補
儘管 CMA 和 NGS 在通量和自動化方面優於 FISH，FISH 仍有不可取代的優勢：（1）單細胞解析度和形態學背景的保留；（2）嵌合體的量化偵測（低比例嵌合 <10% 的敏感度優於 CMA）；（3）balanced rearrangement 的偵測（CMA 無法偵測平衡性易位和倒位）。光學基因組圖譜（Bionano）在結構變異偵測方面與 FISH 互補，長讀長定序（ONT/PacBio）則可在序列層面解析 FISH 觀察到的重排斷裂點。此外，FISH 在產前快速篩檢（間期核 FISH 的 13/18/21/X/Y 五探針組合）中仍廣泛使用，尤其在 CMA 或 NGS 報告等待時間較長的情境下，FISH 可在 24 小時內提供臨床可操作的初步結果。