Woese 的三域系統雖然是演化生物學里程碑，但近年 Asgard 古菌的發現正將其推向修正。
16S rRNA 分子系統發育學的技術基礎
序列比對 (MSA)、距離法 (neighbor-joining)、最簡約法 (maximum parsimony)、最大似然法 (maximum likelihood)、貝氏推論 (Bayesian inference)。16S rRNA 的限制：水平基因轉移 (HGT) 可能模糊訊號、不同區域演化速率不均、單一基因 vs 全基因組不一致。
全基因組系統發育學
串聯多基因 (concatenated alignment)：> 30 個 universal marker genes。基因內容法 (gene presence-absence)。罕見基因組變化 (RGC)：indels、gene fusions。Hsp70 插入：Archaea + Eukarya 有 23 aa insert，Bacteria 無。Prolyl-tRNA synthetase 插入：Archaea + Eukarya 共享。
二域假說 (Eocyte Hypothesis)
Lake (1984) 用 ribosome 形態提出真核生物源自古菌內。初被否認，但 2015 年 Lokiarchaeota 改變局面：Asgard 古菌帶有 ESP (Eukaryotic Signature Proteins)。系統基因組分析將 Eukarya 置於 Asgard 古菌內 → Archaea 呈並系群。若 Asgard 內發生內共生 (proto-mitochondrion uptake) → 產生 LECA。
生命樹 vs 生命網絡
HGT 在早期演化可能極廣泛：「生命樹」根部可能為網狀 (reticulate)。達爾文閾值 (Darwinian threshold)：HGT 頻繁 → 演化以垂直傳遞為主。Woese 稱早期為「progenote」階段。
16S rRNA 方法的現代應用
微生物群 (microbiome) 分析：V3-V4 區域 amplicon sequencing。OTU (97%) vs ASV (amplicon sequence variant, DADA2)。宏基因組 (metagenomics) 可直接組合基因組 (MAG)。
三域在生物科技的應用
Bacteria：抗生素、重組蛋白、CRISPR tools。Archaea：Pyrococcus furiosus DNA polymerase (Pfu, 高保真度 PCR)、thermostable enzymes。Eukarya：CHO cells 生產 therapeutic antibodies。