質譜法（Mass Spectrometry, MS）是基於離子在電磁場中的行為進行分子質荷比測量的分析技術。自 J.J. Thomson（1913）和 Aston（1922 Nobel）的早期工作，到 Fenn（ESI）和 Tanaka（MALDI）的 2002 年諾貝爾獎，MS 已成為生命科學中最強大的分析平台之一。
離子化方法的物理化學
ESI（Fenn, 1989）：溶液從帶電毛細管噴出形成 Taylor 錐，產生帶電液滴。液滴在去溶劑化過程中，依 Rayleigh 極限（q² = 64π²ε₀γr³）發生庫倫爆炸，最終形成裸露的多電荷離子。大分子可帶 10-100+ 電荷，因此高分子量蛋白在質譜上呈現特徵性的「電荷態包絡」（charge state envelope），可透過去卷積（deconvolution）計算精確分子量。nanoESI 使用更細的發射器（~1 μm tip），流速低至 nL/min，離子化效率更高，尤其適合微量樣本。
MALDI（Karas & Hillenkamp, 1988; Tanaka, 1988）：基質（如 sinapinic acid、DHB、CHCA）吸收紫外雷射能量（337 nm N₂ laser 或 355 nm Nd:YAG），將能量轉移至分析物使其氣化並質子化。MALDI 主要產生 [M+H]⁺ 單電荷離子，常搭配 TOF 分析器。MALDI-TOF 是微生物快速鑑定（如 Bruker Biotyper）的臨床標準。
質量分析器的性能指標
解析度（R = m/Δm）：Orbitrap 可達 >500,000（at m/z 200），FT-ICR 可達 >10⁶。質量準確度：Orbitrap < 1 ppm（外部校正），FT-ICR < 0.1 ppm。掃描速度：TOF ~100 Hz，Orbitrap ~40 Hz（依解析度設定），四極桿/離子阱 ~10 Hz。
Orbitrap（Makarov, 2000）：離子注入後沿中心紡錘形電極做軸向簡諧振盪，頻率 ω = √(k/m·z)，FT 解析頻率訊號得 m/z。無需超導磁鐵（cf. FT-ICR），桌上型大小，是目前蛋白質體學的主力（如 Thermo Exploris/Astral 系列）。
定量蛋白質體學
無標記定量（LFQ）：比較不同樣本間同一肽段的 MS1 色譜峰面積或 MS2 光譜計數。穩定同位素標記：SILAC（代謝標記 ¹³C-Lys/Arg）、TMT/iTRAQ（化學標記，多重比較 18-plex）。資料非依賴採集（DIA）：如 SWATH-MS 或 diaPASEF，系統性碎裂所有離子，結合光譜庫實現深度覆蓋（>8000 蛋白/單次運行）。
近年 timsTOF Pro（Bruker）結合離子淌度分離（trapped ion mobility spectrometry, TIMS）與 PASEF 掃描，在 CCS（碰撞截面）維度增加分離，單次 90 min 梯度可鑑定 >10,000 種蛋白質。4D 蛋白質體學（RT × m/z × intensity × 1/K₀）正成為標準配置。
翻譯後修飾分析
磷酸化蛋白質體學需 TiO₂ 或 IMAC 富集磷酸肽。泛素化需 anti-K-ε-GG 免疫沉澱。醣基化需 lectin 富集或 PNGase F 酵素處理。MS 可提供修飾位點的定位（site localization probability）和化學計量比。