細胞工廠是系統代謝工程（Systems Metabolic Engineering; Lee et al., Nat Biotechnol, 2012）的核心實踐，整合 GEM、omics data、synthetic biology tools 和 bioprocess engineering 的全棧方法論。
Strain Design 的計算框架
COBRA 框架下的 strain design 問題可形式化為 bi-level optimization：
外層：max v_target (目標產物通量)
內層：max v_biomass (假設細胞最大化生長)
s.t. S·v = 0, knockout constraints
Bilevel → MILP reformulation (OptKnock; Burgard et al., 2003)。
進階方法：
- OptForce（Ranganathan et al., PLoS Comput Biol, 2010）：不只 knockout，還包括 flux 的 up/down regulation requirement → MUST set（必須改變的 flux）。
- OptCouple（Xu et al., Nat Chem Biol, 2020）：確保目標產物生產是 growth-coupled（knockout 後任何 growth-positive 通量分布都必須有正的 target flux）。這是 robustness 最高的設計。
- Machine Learning-guided DBTL：Bayesian optimization / active learning 在 combinatorial strain library（不同啟動子強度、RBS、基因 copy number 組合）中高效搜索最佳組合。ART (Automated Recommendation Tool; Radivojević et al., Nat Commun, 2020) 整合多輪 DBTL 數據做預測。
Dynamic Pathway Regulation
靜態過表達可能因中間產物毒性或資源浪費而非最佳。解決方案：
- Biosensor-actuated feedback：代謝物濃度感測器（如 transcription factor-based biosensor）驅動 promoter 調控酵素表達。例如 malonyl-CoA 感測器控制 fatty acid synthesis 的動態調控（Xu et al., PNAS, 2014）。
- Optogenetic control：光控 gene expression 實現 temporal switching between growth phase 和 production phase（EL222 / OptoCreVvd 系統）。
Genome-Scale Engineering
- Multiplex Automated Genome Engineering (MAGE)：Wang et al.（Nature, 2009）在大腸桿菌中同時修改多個基因組位置（oligo-mediated recombination），產生 10⁹ 種基因組變體用於 combinatorial screening。
- SCRaMbLE：Sc2.0 合成酵母基因組中的 loxPsym 位點允許 Cre 誘導的隨機重組，產生大規模基因組多樣性。
- Adaptive Laboratory Evolution (ALE)：在選擇壓力下連續培養菌株（如限制碳源 + growth coupling），讓演化找到最佳代謝狀態。whole-genome sequencing 鑑定 beneficial mutations → 理性反向設計。
文獻：Lee et al. (2012) Nat Biotechnol 30:375-383 / Ro et al. (2006) Nature 440:940-943 / Nielsen & Keasling (2016) Cell 164:1185-1197.