分子選殖的概念由 Cohen & Boyer（1973, PNAS）實現——EcoRI 切割 + pSC101 質體 + CaCl₂ 轉化 = 第一個重組 DNA 分子，開創基因工程時代。Asilomar Conference（1975）隨之討論了重組 DNA 的安全性問題。
限制酶的生物學與應用
4,000 種 restriction endonucleases 已被鑑定（REBASE database）。Type II 是選殖的主力（homodimer，辨識 palindrome，在辨識序列內或附近切割）。Type IIS（如 BsaI, BbsI）辨識非回文序列並在下游切割，是 Golden Gate Assembly 和 CRISPR guide RNA cloning 的基礎——可設計 4-nt overhangs 實現 multi-fragment directional assembly。
Gibson Assembly 的反應機制
Gibson et al.（2009, Nat Methods）開發的 isothermal one-pot 方法：
- T5 exonuclease chew back 5' ends → 產生 3' single-stranded overhangs（~20-40 bp homology）
- 互補 ssDNA 退火
- Phusion polymerase 填補 gaps
- Taq ligase 封合 nicks
所有反應在 50°C 等溫 1 小時完成。可組裝 2-6 個片段（最多報導 >10），片段大小 <300 kb。NEBuilder HiFi DNA Assembly 是改良版（使用 proofreading polymerase）。
合成生物學的選殖工具
- DNA synthesis + assembly：合成長達 >1 Mb 的 DNA（Venter 的人工合成 Mycoplasma，Gibson et al., 2010, Science）
- BioBrick / MoClo / SEVA：標準化選殖框架，模組化組裝 promoter-RBS-CDS-terminator
- CRISPR-based genome editing 取代了傳統的 gene targeting（homologous recombination in ES cells）用於小鼠模型製作——效率從 <1% 提升至 >50%
載體工程的前沿
表達載體的優化涉及：codon optimization、mRNA stability elements（WPRE for viral vectors）、inducible promoters（Tet-On/Off, cumate）、self-cleaving peptides（T2A/P2A 多基因表達）。AAV 載體設計需考慮 packaging limit（~4.7 kb）、serotype-dependent tropism 和 immunogenicity。
文獻參考：Cohen, S.N. et al. (1973). PNAS, 70, 3240-3244. / Gibson, D.G. et al. (2009). Nat Methods, 6, 343-345. / Gibson, D.G. et al. (2010). Science, 329, 52-56.