ChIP-seq（Barski et al., 2007, Cell；Johnson et al., 2007, Science）將 chromatin immunoprecipitation（Orlando, 2000）與 NGS 結合，成為表觀基因組學的核心技術。然而 ChIP-seq 存在多個技術限制，促進了新一代方法的開發。
ChIP-seq 的已知限制
- 抗體依賴性：抗體品質是最大變異來源（lot-to-lot variation, off-target binding）。ENCODE consortium 制定了嚴格的 ChIP-seq 抗體驗證標準
- 需要大量細胞：傳統 ChIP-seq 需 10⁶-10⁷ cells → rare cell types 困難
- 交聯偏差：甲醛交聯效率因蛋白質和基因組位置而異；某些蛋白質交聯效率低（如 chromatin remodelers 的暫態結合）
- IP 偏差：epitope accessibility 受染色質環境影響
CUT&RUN 和 CUT&Tag
Skene & Henikoff（2017, eLife）開發 CUT&RUN：抗體結合 intact nuclei → protein A-MNase 招募至結合位點 → Ca²⁺ 活化 MNase 原位切割 → 小片段 DNA 擴散至上清液 → 定序。優點：低細胞量（~1000 cells）、低背景（僅釋放靶位點的 DNA）、無需超聲。
CUT&Tag（Kaya-Okur et al., 2019, Nat Commun）用 protein A-Tn5 transposase 取代 MNase → 原位 tagmentation → 直接建庫，更簡化。CUT&Tag 已成為 histone modification profiling 的首選方法，特別適合稀少細胞和單細胞（scCUT&Tag）。
單細胞表觀基因組學
- scATAC-seq（10x Chromium, sci-ATAC）：~10,000 cells 的染色質可近性圖譜
- scCUT&Tag：單細胞層面的組蛋白修飾定位
- CoBATCH / ACT-seq：單細胞 ChIP-seq 替代方案
挑戰：單細胞的 sparse data（每個細胞僅覆蓋基因組的一小部分）→ 需要計算方法（cisTopic, ArchR, Signac）進行降維和聚類。
整合多組學
ENCODE 4 和 Roadmap Epigenomics（Kundaje et al., 2015, Nature）整合了數百個細胞類型的 ChIP-seq、DNase-seq、RNA-seq → ChromHMM/Segway 將基因組分割為功能狀態（active promoter, strong enhancer, heterochromatin 等）→ 這些注釋被廣泛用於解讀 GWAS non-coding variants。
文獻參考：Barski, A. et al. (2007). Cell, 129, 823-837. / Skene, P.J. & Henikoff, S. (2017). eLife, 6, e21856. / Kaya-Okur, H.S. et al. (2019). Nat Commun, 10, 1930.