火山圖的統計學考量涉及 shrinkage estimators、閾值選擇策略和整合視覺化。
Log₂FC 的 Shrinkage
DESeq2 提供 shrunken log₂FC 估計（apeglm, ashr, normal 三種方法）。未 shrink 的 log₂FC 在低表達基因中方差極大（少量 reads 的 FC 可能非常極端但不可靠）。apeglm（Zhu et al., 2019）以 approximate posterior estimation 縮小低資訊基因的 FC，使火山圖更「乾淨」——高 FC 的點更可能是真正的生物訊號。
S-value 替代 p-value
Greenland（2019）提出 S-value = −log₂(p)，以「最大驚奇量」（bits of information against H₀）取代 p 值。S = 4.3 bits 等價 p = 0.05。在火山圖中用 −log₂(padj) 替代 −log₁₀ 可提供更直覺的證據度量解讀。
MA Plot vs Volcano Plot
MA plot（Bland-Altman for genomics）：X = average expression（A = log₂(mean)），Y = log₂FC（M）。MA plot 揭示效應量與表達量的關係（低表達基因的 FC 方差大），火山圖揭示效應量與顯著性的關係。兩者互補，DESeq2 和 edgeR 都提供 plotMA() 函數。
整合型火山圖
MultiVolcanoPlot：同時比較多個 contrast（如 Tumor vs Normal, Metastasis vs Primary, Resistant vs Sensitive）。方法：(1) 多面板（facet），(2) 重疊標記不同 contrast 的顯著基因（交集和差集以顏色編碼），(3) 搭配 UpSet plot 呈現交集。
閾值選擇的統計考量
固定 FC 門檻（如 |log₂FC| > 1）是任意的。TREAT（Testing Relative to a Threshold, McCarthy & Smyth, 2009）提供 FC 超過某閾值的正式統計檢定：H₀: |log₂FC| ≤ θ，而非傳統的 H₀: log₂FC = 0。在 limma 中以 treat() 函數實作，得到更有生物意義的顯著基因清單。
文獻參考：Zhu, A. et al. (2019). Bioinformatics, 35, 2084-2092. / McCarthy, D.J. & Smyth, G.K. (2009). Bioinformatics, 25, 765-771. / Greenland, S. (2019). Am Stat, 73, 106-114.