scRNA-seq 計算分析涉及從稀疏高維 count data 中提取生物學信號的統計方法學，以及大規模數據的工程挑戰。
Count matrix 的生成與品質
10x Chromium 的 cell barcode 解碼依賴 whitelist matching（~750,000 預定義 barcodes）。Cell Ranger 的 cell calling 使用 EmptyDrops（Lun et al., 2019）——基於 Dirichlet-multinomial 混合模型區分含細胞液滴和環境 RNA 液滴的 barcode profile。Ambient RNA contamination 可用 SoupX 或 CellBender（variational inference-based）進行後續校正，估計每個基因在環境 RNA 中的比例並從 counts 中扣除。
Doublet detection 的計算策略
Scrublet（Wolock et al., 2019）透過人工創建 doublets（隨機混合兩個 cell profiles）並在嵌入空間中計算每個真實細胞附近人工 doublet 的比例來評分。DoubletFinder 採用類似策略但在 PCA 空間中操作。Multi-sample experiments 可以使用 genotype-based demultiplexing（如 Vireo、demuxlet）直接鑑定跨個體的 doublets。
Normalization 的理論考量
scran pooling：將細胞隨機分成 pools，用 pool-level size factors 建立線性方程組求解 cell-level size factors，處理零膨脹問題比 per-cell total count 更穩健。sctransform（Hafemeister & Satija, 2019）對每個基因擬合 regularized NB GLM（UMI count ~ log(total UMI)），殘差即為技術去噪後的表現值。Lause et al.（2021）的 analytic Pearson residuals 提供了數學上更簡潔的替代。
Benchmark 與方法選擇
Luecken et al.（2022, Nature Methods）的 scIB benchmark 系統性評估了 14 種整合方法在 85 個指標上的表現。scANVI（semi-supervised）和 scVI（unsupervised）在整體表現上領先，但 Harmony 在計算效率和表現的平衡上最優。Cell type annotation 的 benchmark（Abdelaal et al., 2019）顯示 supervised methods（如 scPoli、CellTypist）在有高品質 reference 時表現最佳。
Pseudobulk 策略
直接在單細胞層級做差異表現（per-cell DE）會嚴重膨脹 Type I error，因為同一個體的細胞不是獨立觀測。正確做法是 pseudobulk aggregation——先按 sample × cell type 匯總 counts，再用 DESeq2/edgeR 在 sample 層級進行統計檢驗（Squair et al., 2021; Murphy & Skene, 2022）。這確保了統計推論的基本單位是生物重複（individual），而非技術重複（cell）。