蛋白質研究方法橫跨分離科學、結構生物學和功能分析三大領域，現代整合性方法論（integrative structural biology）強調多種技術的交叉驗證。
電泳與免疫偵測
SDS-PAGE 的理論基礎：SDS 以 ~1.4 g/g protein 的固定比例結合，提供均勻的 charge-to-mass ratio（~1 negative charge per 2 residues）。Ferguson plot（log mobility vs. %T acrylamide）可區分分子量差異與電荷差異。原態膠體電泳（native PAGE）和藍色原態電泳（BN-PAGE）保留蛋白質的四級結構和活性，用於分析膜蛋白複合體。2D-PAGE 結合等電聚焦（IEF, 第一維度, 按 pI 分離）和 SDS-PAGE（第二維度, 按分子量分離），理論解析度可分離數千種蛋白質。
Western blot 的定量限制：抗體親和力的線性範圍有限，傳統化學發光（ECL）的動態範圍僅約 2 個數量級。近紅外螢光系統（如 LI-COR）改善至 ~4 個數量級。定量 Western 需要適當的 loading control（如 total protein staining 優於 housekeeping gene）和標準曲線。
質譜蛋白質組學
Bottom-up proteomics 的標準工作流：蛋白質提取 → 還原烷化 → trypsin 消化 → 肽段分離（nanoLC, C18 反相管柱）→ ESI-MS/MS → database search（Mascot, MaxQuant, MSFragger）。資料獲取模式包括：DDA（data-dependent acquisition，選擇最強訊號的前驅離子進行 MS/MS）和 DIA（data-independent acquisition，如 SWATH-MS，對所有前驅離子進行系統性碎裂，提供更完整的定量覆蓋）。
定量策略：label-free quantification（LFQ, 基於離子強度或 spectral counting）；穩定同位素標記（SILAC 用 ¹³C/¹⁵N 胺基酸代謝標記；TMT/iTRAQ 化學標記可同時比較多達 18 個樣本）。Top-down proteomics 分析完整蛋白質而不經酶切，可保留 proteoform 資訊（翻譯後修飾的組合模式），但對儀器解析度和靈敏度要求極高（Orbitrap 或 FT-ICR）。
結構生物學三大支柱
X 光結晶學：相位問題（phase problem）的解決策略包括分子置換（molecular replacement, MR）、多波長異常散射（MAD, 用 Se-Met 標記）和單波長異常散射（SAD）。R-factor 和 R-free 用於評估模型品質。
冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）：單顆粒分析（single-particle analysis, SPA）的革命性進展源於直接電子偵測器（DED）和貝葉斯重建算法（如 RELION）。2017 年諾貝爾化學獎授予 Henderson、Frank 和 Dubochet。目前對稱性高的大型複合體（如核糖體、GroEL）可達 <2 Å，但小型蛋白質（<50 kDa）仍具挑戰。Cryo-ET（cryo-electron tomography）結合 subtomogram averaging 可在原位（in situ）觀察細胞內的分子機器。
AlphaFold2（Jumper et al., 2021）以深度學習預測蛋白質結構，在 CASP14 中達到實驗精度，已革命性地改變結構生物學——但預測的 pLDDT 分數提示，無序區域和蛋白質交互作用界面仍需實驗驗證。