輔酶（Coenzymes）是酵素催化中不可或缺的有機輔因子，其化學反應性彌補了 20 種標準胺基酸側鏈在催化反應類型上的限制。Fischer 的「酵素-受質」概念應擴展為「全酶（holoenzyme）= 脫輔基酶（apoenzyme）+ 輔因子」。
NAD⁺/NADH 的生化邏輯
NAD⁺ 的菸鹼醯胺環接受 hydride（H⁻，即 2e⁻ + H⁺）進行兩電子還原，立體化學上分為 A-face 和 B-face 特異性——不同的去氫酶（dehydrogenase）將 hydride 傳遞到 NAD⁺ 的特定面（如 alcohol dehydrogenase 是 A-face 專一性）。NAD⁺/NADH 的標準還原電位 E°' = -0.32 V，在代謝中作為分解代謝（catabolism）的電子收集器。
NADP⁺/NADPH 結構上僅在 2'-OH 多一個磷酸基，但生理功能截然不同：NADPH 專門供應同化代謝（anabolism）的還原力，如脂肪酸合成和谷胱甘肽還原。細胞維持高 NAD⁺/NADH 比（~700:1，驅動氧化）和高 NADPH/NADP⁺ 比（~100:1，驅動還原），這種動力學分離由不同的合成和消耗途徑維持。
輔酶 A 的硫酯化學
CoA 的活性基團是末端的硫醇基（-SH）。硫酯鍵（R-CO-S-CoA）的 ΔG°'hydrolysis ≈ -31.4 kJ/mol，接近 ATP 水解的能量，因此乙醯 CoA 是「活化的乙醯基」。硫酯的高能量來自硫的 3p 軌道與羰基 π 系統重疊不佳（相較於 oxygen ester 的 2p-2p 共振穩定），使硫酯的羰碳更具親電性。
CoA 參與的關鍵代謝節點：pyruvate dehydrogenase complex（丙酮酸 → 乙醯 CoA）、citrate synthase（乙醯 CoA + OAA → citrate）、fatty acid β-oxidation（每輪釋放一個 acetyl-CoA）和 fatty acid synthesis（malonyl-CoA 為建構單元）。
PLP（磷酸吡哆醛）的催化多功能性
PLP 是最具反應多樣性的輔酶，能催化至少四種不同類型的 α-胺基酸反應：轉胺（transamination）、去羧（decarboxylation）、β-消除（β-elimination）和 α,β-消除/取代。Dunathan 假說（1966）解釋了反應專一性：被切斷的鍵必須與 PLP 的 π 系統垂直排列，以最大化共軛穩定 carbanion 中間體。酵素活性位點透過控制受質的結合構象來決定切斷哪一條鍵。
TPP（硫胺素焦磷酸）的碳負離子化學
TPP 噻唑環的 C2-H 具有異常高的酸性（pKa ≈ 18），去質子化後形成 ylide（碳負離子），可對 α-酮酸的羰基進行親核攻擊。這種獨特的碳負離子化學是 pyruvate dehydrogenase、α-ketoglutarate dehydrogenase 和 transketolase 的催化基礎。TPP 缺乏（維生素 B₁ 不足）導致 pyruvate 和 α-ketoglutarate 無法去羧，高能組織（神經、心臟）首先受損——Wernicke-Korsakoff 症候群（酗酒者常見）的分子基礎。
金屬離子輔因子
嚴格來說金屬離子不是「輔酶」（非有機），但功能上互補。Zn²⁺ 在 carbonic anhydrase 中活化水分子（降低 H₂O 的 pKa 從 15.7 到 ~7），在 carboxypeptidase A 中極化受質的羰基。Fe-S clusters 在電子傳遞鏈中進行單電子轉移（Fe³⁺ ↔ Fe²⁺），其還原電位可由蛋白質微環境從 -0.4 V 調節至 +0.4 V。